世界级专家建议 如何进行循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因检测

欧洲肿瘤医学学会(英文缩写是ESMO，是欧洲一个研究肿瘤学有关的专业组织。欧洲肿瘤医学学会成立于1975年，截至2021年，该组织会员来自全球150多个国家的25000多名肿瘤学专业研究人员。

2022年7月6日，《肿瘤学年鉴/Annals of Oncology》医学期刊上欧洲肿瘤医学学会的精准医学工作小组发表了关于癌症患者使用循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因检测的新建议，精准医学工作小组的专家强调了在检测前、阅读报告然后将研究结果转化为临床处时需要考虑的主要问题和重要的建议，并支持ctDNA可以作为晚期癌症患者基因分型和治疗选择操考的标准。此外，在新的建议当中，还就循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因检测在未来的其他可能应用的场景提供了一些见解，例如癌症筛检，微量残存疾病(minimal residual disease简称MRD)的评估与监测和用于治疗反应的早期评估，但这些见解仍然缺乏实用性的证据。

液态切片（液体活检）是一个广泛性的概念，包括对于ctDNA、CTC(也就是循环肿瘤细胞)与外泌体等，其中以ctDNA的临床应用最为广泛，这主要归因于其具有微小的创伤性，且具有随时间推移可以重复取样的特色。ctDNA的释放被认为与肿瘤生长之间成正比，生长最快速的癌细胞分支会比较容易在血浆中脱落出的DNA量也最多。目前有多种检测、提取和量化ctDNA的技术和模式可供使用，深入了解实验室开发或商业化ctDNA检测分析的临床有效性及实用性，对于解决特定的临床问题是至关重要的。

ctDNA是肿瘤细胞死亡、凋亡或坏死后释放到血液循换中的癌细胞DNA，是cfDNA的一部分。正常cfDNA的片段大小大约是在166bp，而ctDNA的片段则较短，大约为143~145bp左右。其次，血浆ctDNA的半衰期较短（通常小于2个小时），主要是由肝脏和肾脏清除代谢。

ctDNA目前具有多种潜在的临床应用，包括癌症筛检、早期疾病表征、局部治疗(例如手术切除肿瘤)后MRD检测和癌症复发的分子医学上监测；晚期癌症则可以依据其基因分型给予相应的治疗、癌症治疗效果的更早期评估、癌症治疗反应监测和癌症治疗抗药机制的识别。

尽管理论上ctDNA的基因检测，应该可以比传统的肿瘤组织的基因检测提供更多关于肿瘤空间和时间异质性的重要信息，但在常规临床实务上的使用需要仔细注意分析前的检体处理和选择合适的检测技术，这可能影会响最终得到的ctDNA的基因检测结果。为此，该精准医学工作小组的专家发布ctDNA的基因检测的新建议，目的在解决ctDNA的基因检测的主要技术问题并提供决策所需的一些质量标准。

欧洲肿瘤医学学会的精准医学工作小组是如何建议循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因检测，有以下的重点:

1. 对于晚期癌症患者，透过官方及科学验证且足够灵敏的ctDNA检测平台，可以用于癌症的基因分型，并指导相对应的标靶治疗。
2. 当临床需要快速检测结果以做出紧急治疗决策的当下，但面临肿瘤组织样本不可用或质量堪忧时，应该可以考虑使用ctDNA检测进行癌症的基因分型。
3. 由于ctDNA检测的假阴性结果（对基因融合和拷贝数变异检测灵敏度较低），应该考虑在ctDNA检测为阴性结果时，立即进行返馈式的肿瘤组织的基因检测（Reflex tumor testing），尽可能在组织中复检。
4. 在早期癌症患者中，微量残存疾病(minimal residual disease简称MRD)的ctDNA评估对于侦测许多癌症复发上面，具有很高的临床上探查癌症复发与否有效性之价值；但由于缺乏临床实用性的证据
5. 目前没有证据表明微量残存疾病(minimal residual disease简称MRD)的评估可以用于指导临床治疗），不推荐常规临床实践中使用ctDNA去检测MRD。
6. ctDNA检测的其他潜在性的应用，目前还正在研究开发中，不推荐用于常规的临床实务上面，包括通过ctDNA水平的早期动态变化来确认对目前的治疗有无反应，以及癌症筛检等。

欧洲肿瘤医学学会的精准医学工作小组对于ctDNA基因检测技术方面的建议:

1. ctDNA检测的抽血时间方面，应该根据临床情况来谨慎选择，因为不同的因素确实会影响ctDNA的释放（例如，正在接受的治疗、并发有发炎反应手术）。手术后检测微量残存疾病(minimal residual disease简称MRD)的ctDNA评估，理想情况下应该在手术后至少1周后才进行，对于伤口愈合时间较长的大手术，则可能需要2周或更长时间。而晚期癌症的ctDNA检测来协助癌症基因分型，在积极治疗有效或无肿瘤疾病恶化时候应该避免抽血，以尽量减少假阴性结果。
2. 在血液样本采集管选择时，应该根据ctDNA处理的时间和所使用的检测方法进行选择（例如，选择EDTA采血管、或是cfDNA采血管）。
3. 如果血浆样本暂时不进行ctDNA的萃取，应该长期储存在 -80℃，温度变化最小，并且尽可能减少连续的冻融。
4. 假阴性（指的是实际存在于肿瘤中、但未检测出的基因变异）是ctDNA检测的一个重要问题，可能是血浆ctDNA的水平太低、检测灵敏度不足或“非脱落”肿瘤（non-shedding tumor，即肿瘤本身不释放出ctDNA）所导致。
5. 意义未明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential ，简称CHIP）的基因突变是ctDNA检测中假阳性的常见原因，因此，建议需要对血浆ctDNA和白血球DNA进行同步检测分析，进而排除CHIP突变。
6. ctDNA的基因检测可能会检测到癌症易感基因的致病性遗传性的基因变异（例如，BRCA1，BRCA2，PALB2），并且此类变异的检测需要使用经过验证的检测方法进行返回式检测，以确认是否为体系变异还是胚系变异。
7. 未来，临床基因分型的基因检测应该适用于评估肿瘤纯度，以便对未检测到的结果进行可靠性预测，并可靠的进行真阴性的预测。这可以透过生物信息的分析来实现。

欧洲肿瘤医学学会的精准医学工作小组对于ctDNA基因检测之临床实用性方面的建议:

特殊肿瘤部位建议：

血浆ctDNA基因检测的灵敏度在癌症转移至中枢神经系统时和原发性脑肿瘤中是较低的，ctDNA基因检测不适合对此类患者进行基因分型，但如果这是基因分型的唯一样本来源，可以尝试看看。

关于晚期癌症的基因分型上的建议：

1. 对于晚期癌症患者，经过官方及科学验证且足够灵敏的ctDNA检测可用于常规临床实务上的基因分型并且可指导标靶治疗的使用。
2. ctDNA基因检测可以作为肿瘤组织基因检测的替代性选择，特别是对于临床需要快速检测结果以做出紧急治疗决策的侵袭性癌症，例如非小细胞肺癌等。这同样适用于肿瘤组织切片不可用或不合适的情况。
3. 当癌症病情恶化时，无论是首次治疗、还是后线的治疗，都应该透过ctDNA基因检测来进行基因的分型。当肿瘤对治疗有反应时采取样本再进行ctDNA基因检测，此时的灵敏度会降低。
4. 对于晚期癌症的基因分型，临床实务上选择 RT-PCR、dPCR 和 NGS 检测平台，如何选择应该要根据临床上的可获得性、费用报销的状态和每种肿瘤类型的“1级可治疗的癌症基因变异”的数量来确定。
5. 对于高外显率的癌症易感基因（例如BRCA1、BRCA2、PALB2）的致病性变异基因的解读应该要谨慎；应该要使用经过验证的遗传性基因检测的方法来加以确认体系变异和胚系变异。
6. 考虑到ctDNA基因检测的适度临床敏感性和阴性预测值，对于未检测到可以有药物作用的变异基因的检测结果，应该要进行返馈式的进行肿瘤组织的基因检测。对于专业用户，如果可以确认血液样本中存在有足够的ctDNA纯度（整体ctDNA水平或检测到的变异的等位基因频率分析），可能不需要进行返馈式的肿瘤组织的基因检测。
7. ctDNA基因检测对于基因融合和拷贝数变异的灵敏度比较低，如果条件允许，应该在肿瘤组织的基因检测去检测这些变异。
8. 所有肿瘤科医生都应该有机会接触分子肿瘤专家委员会（MTB），应该早期接受相关的训练，以确保对结果的正确解释，并对疑难病例进行讨论以确保做出适当的医疗决策。

欧洲肿瘤医学学会的精准医学工作小组对于ctDNA基因检测之早期癌症分子复发与微量残存疾病(MRD)的建议：

1. 多项临床有效性的研究正式，对早期癌症接受治愈性的局部治疗后，采用经过验证优化的ctDNA基因检测MRD的方法，可以预测未来复发的风险。
2. 在缺乏前瞻性临床试验证据支持的情况下，目前没有证据表明ctDNA基因检测MRD的方法可用于指导早期癌症的临床治疗或对于早期癌症安全地去强化的治疗。

综合而言，液态切片，尤其是ctDNA基因检测，越来越广费地用于临床实务的治疗上，并且已经有足够的证据证实ctDNA基因检测协助晚期癌症基因分型的临床效用，指导正确的临床治疗，特别是在肿瘤组织检体不意取得或不理想时，或时间至关重要的情况下。

临床应用上必须考虑ctDNA基因检测在检测基因融合和拷贝数变异的灵敏度较低，以及ctDNA基因检测有可能会出现CHIP突变而引起“假阳性”结果的问题。此外，由于缺乏实用性证据，因此不建议将ctDNA检测用于其他可能的目的，如癌症筛检，早期癌症分子复发与微量残存疾病(MRD)和治疗反应的早期评估。目前正在开发新的ctDNA基因检测技术，例如亘具甲基化模式的基因测序、基于片段化模式的基因测序、或是新型超灵敏突变检测方法。目前许多正在进行的临床试验可能为在多种临床场景下，采ctDNA基因检测并进行决策提供更有力的实证基础。

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