血液腫瘤科/細胞治療中心/台灣細胞免疫醫學會 陳駿逸醫師
循環腫瘤DNA (ctDNA) 檢測是一種透過分析血液中微量腫瘤基因片段（液態活檢）的技術，具有非侵入性、可連續性抽血檢測、反映腫瘤異質性、靈敏度高的特色。它主要根據次世代基因定序 (NGS)，常見方法包括標靶定序、全外顯子組定序 (WES) 等分子技術，能夠即時監測癌症治療反應、評估微小殘留病灶 (MRD)、預測復發風險，並在組織樣本不足時尋找標靶治療機會，應用於肺癌、乳癌、大腸直腸癌等多種實體癌。ctDNA檢測在手術或化療後檢測血液中的 ctDNA，若檢測陽性通常提示體內仍有微量殘存疾病，高復發風險ctDNA檢測可以即時追蹤腫瘤對化療、標靶治療或免疫治療的反應，水平下降反映治療有效。ctDNA檢測亦可偵測癌症治療過程中產生的新基因突變（例如 EGFR T790M），協助醫師及時調整治療策略。
ctDNA檢測可以偵測腫瘤細胞死亡釋放的微量DNA，有望在影像學檢查發現腫瘤前早期發現癌變，能比傳統影像學檢查能夠更早發現癌症，但存在有假陽性/陰性風險，但需要結合臨床評估。但由於早期癌症患者血液中ctDNA含量極低，可能會導致ctDNA檢測的假陰性；而即使ctDNA檢測檢測出突變，也可能是其他良性疾病所引起（假陽性）。所以目前普遍認為ctDNA的檢測，是
無法完全取代影像學對於癌症的篩檢，ctDNA檢測通常用於診斷癌症的輔助工具，需與傳統影像檢查（如CT、MRI、內視鏡）結合，才能更精準地定位腫瘤。
然而如何透過ctDNA檢測技術的創新，來突破ctDNA檢測的檢測靈敏度的瓶頸，為結大腸直腸癌患者的術後管理和早期篩查提供更為精准的分子標誌物，則是撰寫本文的初衷。
目前已證實體內幾乎任何部位的癌症都會將其癌細胞的DNA釋放入血液循環中，成為ctDNA，而ctDNA的半衰期極短，僅為數分鐘至數小時，這與半衰期約一周的腫瘤指標之癌胚抗原（CEA）形成鮮明的對比。正是這一生物學特性使得ctDNA能夠即時反映患者體內的腫瘤負荷，從而為前瞻性地調整癌症患者的治療策略提供了可行性。然而，ctDNA檢測面臨的核心挑戰在於血液中絕大多數游離DNA來源於非腫瘤的白且球，如何在ctDNA檢測中，於這些“背景雜音”中檢出低頻的腫瘤來源DNA片段，恰如在“大海中撈針”。
研究已應用早期的ctDNA檢測技術證實ctDNA是大腸直腸癌患者的預後之生物標誌物，術後ctDNA未驗出的腸癌患者復發風險，會顯著低於ctDNA陽性患者，且ctDNA的預後判斷價值是明顯優於腫瘤指標之CEA。
隨著二代基因測序技術(NGS)的發展，研究者能夠為每個DNA分子添加獨特的分子條碼，從而實現更精確的定量分析，ctDNA檢測的檢測下限也隨之降低。將該技術應用於2期和3期大腸直腸癌患者，大規模研究一致表明術後術後ctDNA未驗出的患者其癌症復發風險顯著降低，且這一結論獨立于傳統的臨床癌症病理分期標準，提示ctDNA可能優於常規臨床病理指標。可以作為預後評估的工具。
當前最先進的ctDNA檢測技術採用雙鏈測序策略，該技術實現了錯誤率的指數級下降。腫瘤會呈指數增長，手術可使腫瘤的負荷急劇下降，但若存在微小的癌症殘留病灶，腫瘤細胞將逐漸增殖。若能以高靈敏度的分子技術在殘留癌病灶負荷極低、尚處於緩慢上升的階段，即檢測出ctDNA陽性信號，此時癌細胞數量少、耐藥突變發生概率低，任何治療手段的有效率都會是最好。相反，若採用靈敏度較低的技術，ctDNA檢出陽性時之癌細胞病灶負荷已相對較高，此時癌細胞出現抗藥克隆的可能性增加，治癒機會會相對降低。若完全缺乏早期檢測手段，患者以廣泛轉移性疾病就診時，癌症要完全控制會極為困難。因此，癌病負荷較低時的早期檢測之窗口是至關重要。
如何進一步提高檢測ctDNA檢測的靈敏度？在DYNAMIC-II研究中針對2期腸癌患者的探討。研究思路是增加每例患者檢測的突變位點數量，然而，若技術本身存在了一定的背景雜音，追蹤更多位點反而會累加更多的背景信號。該
研究採用了兩種tumor-informed panel策略：一種是涵蓋大腸直腸癌中15個常見突變基因，每例患者平均可檢出約3個驅動基因突變；另一種基於全基因組或全外顯子測序，檢測範圍擴展至整個基因組或全部編碼區，每例患者平均可追蹤出約29個突變，數量提升了約10倍。結果顯示，如此ctDNA檢測的靈敏度會從57.1%提升至85.5%，特異度同樣會有所提高。特異度提升的原因在於突變位點數量增加後，可以選擇背景雜音最低的位點進行追蹤，而不必局限於驅動突變，從而實現了更優的ctDNA檢測的檢測性能。相應地，ctDNA檢測的陽性預測值和陰性預測值也會隨之提升。
研究團隊進一步將該方法應用於術後ctDNA檢測呈現陽性且接受術後輔助化療的腸癌患者，在化療結束後4至6星期後採集單一時間點的血液樣本進行ctDNA檢測檢測。結果表明，化療後ctDNA檢測從陽轉陰的患者預後良好，32例中僅1例復發，且復發發生在第4年；相比之下，化療後ctDNA仍可驗出的6例患者，均在3年內復發。
並非所有情況都能獲取得原發腫瘤的組織，此時則需改採用tumor-agnostic策略。tumor-informed策略可為每例患者定制個體化ctDNA檢測的panel，靈敏度和特異度均較高，類似於“根據指紋尋找犯罪嫌疑人”；而tumor-agnostic策略則如同“僅憑特徵就在人群中篩查”，靈敏度則會相對較低，但無需等待原發腫瘤的基因測序，就可隨時應用的ctDNA檢測。
研究團隊在ARIC研究中嘗試了一種創新思路為：能否在沒有原發腫瘤的情況下實現tumor-informed策略的優勢？該研究利用了一組心血管疾病評估項目中保存的歷史血漿樣本，樣本採集于40餘年前，且每例患者均有距指標時間點數月至約3年的連續血漿。研究選取了26例在指標時間點後約6個月內確診癌症的患者作為病例組，並設有對照組。首先，研究團隊以涵蓋大腸直腸癌中常見突變基因之套組去檢測指標時間點血漿，26例中8例呈陽性，揭盲後這8例均確診為癌症，特異度達100%。其中4例為大腸直腸癌，分期涵蓋1期、2期和3期，均在血漿採集後4個月內確診。
更具開創性的是，研究團隊對指標時間點血漿進行深度的全基因組測序，以配對白血球之DNA來排除胚系突變和克隆性造血之干擾，據此設計包含最多96個突變位點的個性化套組，再將該panel應用于同一患者3年前採集的極早期血漿。這一設想頗為大膽——能否在臨床診斷前3年就檢出ctDNA？結果出乎意料：6例可檢測的患者中，4例在診斷前3年的血漿中即已經驗出ctDNA，其中1例為1期大腸癌。比較兩個時間點的突變等位元基因頻率（MAF），診斷前數月的血漿MAF會顯著高於3年前，符合腫瘤逐漸增殖的預期。ctDNA在臨床診斷前3年即可被驗出，但所需的檢測靈敏度約為診斷前數月所需靈敏度的50倍。
現有研究證據支持使用ctDNA做為檢測微小殘留病灶的高靈敏度之定量生物標誌物。近年來的分子技術進步，包括不斷演進的高精度機[恩測序技術以及追蹤大量突變位點的個體客製化的檢驗套組，提升了ctDNA檢測的靈敏度。未來，採用這些先進ctDNA檢測技術所進行的前瞻性干預性臨床試驗。將是驗證ctDNA臨床癌症篩檢是否具有實用價值的關鍵。
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